中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 李呈军、步志高和陈化兰发表了题为Avian influenza vaccines against H5N1‘bird flu’ 的综述，这是一篇教科书级别重要论文。

H5N1禽流感病毒传播广泛，跨越3个大陆60余个国家。为控制该病，许多感染国家，尤其是H5N1已经在禽类和野鸟中呈地方性流行的国家，对禽类实施免疫。近来，禽流感疫苗的研制，尤其是重组病毒载体疫苗和DNA疫苗的研制，取得了很大进展。

本文章探讨在H5N1禽流感疫苗的研制和使用方面取得的最新进展。了解新疫苗的特性有利于国家免疫程序的制定，从而有助于有效控制和阻止H5N1禽流感传播。

为了方便阅读，我们将分两篇讲述陈化兰院士团队的这篇论文。本篇先介绍H5N1禽流感疫苗的研制取得的最新进展。

本部分内容大纲

一、灭活的全病毒疫苗

二、重组病毒载体疫苗

1.禽痘病毒载体疫苗

2.新城疫病毒载体疫苗

3.火鸡疱疹病毒载体疫苗

4.鸭肠炎病毒载体疫苗

5.传染性喉气管炎病毒载体疫苗

三、DNA疫苗

四、H5N1禽流感疫苗使用方面的研究进展

以下正文

一、灭活的全病毒疫苗

在20世纪40年代，灭活的全病毒疫苗问世，用来控制和阻止人流感。在过去的30年中，这种疫苗是养禽业用以控制禽流感病毒的重中之重。为了抗击印度尼西亚爆发的H5N1禽流感，一种以高致病性疫苗种毒A/chicken/Indonesia (Legok)/03 (H5N1)研制出的灭活疫苗被用来免疫鸡。然而，选择一种高致病性的病毒作为疫苗种毒存在很多问题。例如，在生物安全方面，高致病性的病毒对疫苗生产部门有潜在威胁。另外，高致病性H5N1疫苗种毒经常在48小时内杀死鸡胚，使得尿囊液中病毒滴度很低。

使用传统的方法不能研制低致病性H5N1疫苗种毒。反向遗传技术的发展和应用引发了H5N1流感疫苗的变革。使用这种技术，表达H5N1病毒HA和NA基因质粒的病毒RNA，高产病毒A/Puero Rico/8/1934 (H1N1)（PR8）的六个内部基因，以及编码多聚酶和核蛋白的四个PR8蛋白表达质粒共同转染Vero细胞，产生病毒RNA和蛋白，形成H5N1/PR8疫苗种毒（见图1）。

图 1.制备H5N1疫苗种毒的反向遗传操作系统示意图

在病毒RNA表达质粒的构建过程中，在HA裂解位点去除多个碱性氨基酸，使其变成低致病性流感病毒。

通过使用反向遗传技术，田国彬等人研制出了一种基于A/goose/Guangdong/1/96（在中国分离到的第一株高致病性H5N1病毒）的H5N1灭活禽流感疫苗，并将其命名为H5N1/PR8（2+6）。这种疫苗种毒具有极好的生物安全特性。它在鸡体致弱，对鸡胚无致病性。这种疫苗种毒在鸡胚中有效复制，尿囊液中病毒滴度比A/goose/Guangdong/1/96病毒增长4-6倍。因此，可以直接利用尿囊液制备灭活疫苗而不用进一步纯化。用这种疫苗免疫后再攻击同源或异源性H5N1病毒，鸡、鸭、鹅都能被完全保护。

大量研究也证明了灭活全病毒疫苗对抗H5N1感染的免疫效力。

这些研究中的疫苗种毒来自于低致病性H5N2和H5N9病毒，或者来自于通过反向遗传技术基于PR8拯救的H5N1或H5N3疫苗种毒。

这些研究中的疫苗效力也各不相同，包括完全保护、部分保护、发病、死亡等等。

疫苗的免疫效果与疫苗抗原性、攻击的毒株、HA抗原量、免疫程序相关。在这些因素中，疫苗种毒与野毒的抗原高度一致性对抗击H5N1病毒，发挥免疫保护至关重要。当抗原出现变异时，这些疫苗便不能完全保护。因此，实时监测、抗原性分析、及时更新疫苗毒株就显得至关重要。

二、重组病毒载体疫苗

和灭活疫苗相比，重组的病毒载体疫苗能够引发更多的辅助性T细胞（Th1和Th2）产生免疫反应。总的来说，用其他病毒作载体研制的重组H5N1禽流感疫苗可以对两种病毒疾病提供保护，这使得管理便利，成本减少。而且，重组疫苗只表达H5N1病毒的HA基因，这有利于通过血清学检测来区分感染病毒的亚型。

目前为止，一系列基于不同病毒载体的重组H5N1流感疫苗已经被研制出，这些载体包括禽痘病毒载体、新城疫病毒载体、火鸡疱疹病毒载体、鸭肠炎病毒载体以及传染性喉气管炎病毒载体（见表1）。

表1.高致病性H5N1禽流感的多种重组病毒载体疫苗

1、重组禽痘病毒载体疫苗

重组禽痘病毒载体疫苗是第一个通过使用基因工程成功研制的活载体疫苗。

重组禽痘病毒载体疫苗在1988年首次研发、注册并用于控制墨西哥H5N1禽流感病毒。免疫这种疫苗的鸡，即使其抗体水平较低甚至没有，也能受到保护。

这表明，该疫苗引发的细胞免疫在免疫保护中发挥重要作用。

表达A/goose/Guangdong/1/96病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒载体疫苗在中国已经被批准使用。它可以保护鸡不受H5N1和H7N1高致病性病毒的致死性攻击。研究表明，这种疫苗产生的中和抗体可以持续存在40周。在免疫后一周，重组禽痘病毒载体疫苗就能对同源性流感病毒的攻击产生保护力。

重组禽痘病毒载体疫苗有几个缺点。

首先，免疫这种疫苗不能保证完全无毒，这从喉头和泄殖腔拭子排毒可以看出。

其次，免疫效果可被禽痘病毒的母源抗体干扰。在使用这种重组禽痘病毒载体疫苗之前使用传统的禽痘病毒疫苗会干扰重组疫苗的效果。

第三，这种疫苗需要通过翅静脉穿刺或皮下注射免疫，耗费人力，引起不便。

最后，对肉鸡使用这种疫苗没有优势，因为肉鸡不必免疫禽痘病毒疫苗。

因此，对肉鸡来说，这种想要通过一种疫苗来对抗两种传染病的目的并没有达成。

2、重组新城疫病毒载体疫苗

新城疫是一种由新城疫病毒引起的高感染性疾病。在许多国家，肉鸡场使用弱毒活新城疫疫苗是必不可少的。每年弱毒新城疫疫苗的使用剂量仅中国就达到了三百亿。因此，使用弱毒新城疫疫苗来研制一种重组新城疫载体H5禽流感疫苗可以同时阻止两种致死性传染病：禽流感和新城疫。

Swayne等人通过一种高度致弱的B1毒株构建了一种表达H7禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒，这种病毒在对抗高致病性H7禽流感和新城疫中提供部分保护。相比之下，利用轻微致弱的Lasota株或它的衍生物Clone30构建的重组新城疫疫苗能更好的引发抗体反应，提供免疫保护。葛金英等人，以及Nayak等人的研究表明，使用Lasota株，并表达H5N1禽流感病毒HA基因的重组新城疫疫苗能够引发很好的抗体反应，并对新城疫病毒和同源以及异源H5N1禽流感病毒的致死性攻击提供完全的免疫保护。

和灭活疫苗相比，重组新城疫疫苗对抗原性不同的H5N1病毒的免疫保护效果有所下降。因此，当发现抗原变异时，对重组新城疫病毒载体疫苗中的H5的HA基因进行更新必不可少。

另外，母源新城疫抗体会干扰重组新城疫活疫苗的免疫效果。因此，需要根据母源抗体的水平来优化免疫程序。重组新城疫疫苗和重组禽痘病毒疫苗联合使用可以对抗H5N1病毒，提供长期的免疫保护。

二价重组新城疫病毒载体H5-HA疫苗有几大优点，包括生产简单、高产、免疫方法便捷、可引发黏膜免疫等。

3、重组火鸡疱疹病毒载体疫苗

火鸡疱疹疫苗已被广泛使用于控制马立克氏疾病并被用来研制重组二价疫苗以对抗传染性法氏囊和新城疫。

火鸡疱疹病毒载体疫苗免疫方便，可通过鸡胚（18日龄鸡胚）免疫或鸡群免疫（1日龄雏鸡）。使用传染性细菌人工染色技术（BAC），将H7的HA基因插入到火鸡疱疹病毒的UL45-46之间，构建重组火鸡疱疹病毒载体H7疫苗。免疫1日龄雏鸡后攻击同源H7N1病毒，能够提供完全保护，不排毒，不发病，不死亡。

几个相关研究也检测了重组火鸡疱疹病毒载体H5-HA疫苗的免疫效力。对于重组火鸡疱疹病毒载体H5-HA疫苗，H5的HA基因插入到US2位点比插入到US10位点能提供更好的保护。它可以对抗原相关H5N1病毒提供临床保护，但是对抗原突变株的免疫保护力下降。

有趣的是，对有母源火鸡疱疹病毒抗体和母源H5N1禽流感抗体的商品肉鸡攻击H5N1禽流感病毒，重组火鸡疱疹病毒H5-HA疫苗仍能提供70%-90%的临床保护。

为增强火鸡疱疹病毒载体疫苗的免疫效力，需对不同的免疫程序例如疫苗的剂量进行进一步的研究。

4、重组鸭肠炎病毒载体疫苗

感染H5N1禽流感病毒的鸭通常不发病或死亡，但是向环境中大量排毒。因此，在H5N1病毒传播给易感动物和人时，鸭相当于“木马”。

H5N1病毒的木马计

鸭子“木马 ”

在亚洲国家，鸭的养殖数量十分巨大。仅中国每年鸭的养殖量就达到40亿只，相当于全世界的75%。但是，由于H5病毒不会对鸭产生明显疾病，鸭农不愿使用灭活H5N1疫苗，因而，鸭的免疫覆盖区域很小。

鸭病毒性肠炎是由鸭肠炎病毒引起的一种致死性传染病。

从20世纪60年代起，弱毒活鸭肠炎病毒疫苗已经被研制出，并在中国定期使用来控制鸭病毒性肠炎，每年该疫苗的使用剂量能达到几十亿。因此，研制一种重组鸭肠炎病毒载体H5禽流感疫苗有很大优势，因为它能被用来同时控制鸭病毒性肠炎和H5N1禽流感病毒（见图2）。

图 2.一种对抗H5N1禽流感的新型鸭肠炎病毒载体疫苗的研制过程

Liu等人研制了两种重组鸭肠炎病毒载体H5-HA疫苗，H5的HA基因分别插入到鸭肠炎病毒基因组的不同位置。实验研究证明，这些鸭肠炎病毒载体疫苗具有免疫原性，并能对H5N1禽流感病毒和鸭肠炎病毒产生坚实保护。

这种疫苗最大的优点是产生保护效力的速度很快，在免疫的当天便可对鸭病毒性肠炎的攻击产生完全保护，在免疫后7天，就可对抗H5N1禽流感病毒的攻击（见图2A和表1）。这种疫苗的使用可以成功降低鸭对H5N1禽流感病毒的易感性，从而减少或消除传染源，同时还能有效对抗鸭肠炎病毒。

重组鸭肠炎病毒载体H5疫苗对鸡也安全有效。7日龄肉鸡免疫该疫苗一周后，可产生免疫保护，并在肉鸡的整个生长阶段产生持续保护（见图2C和表1）。

与其他的重组疫苗不同，重组鸭肠炎病毒载体疫苗可使鸡完全免于母源抗体的干扰。这种重组病毒能在鸡胚成纤维细胞上大量繁殖，可降低成本。另外，重组鸭肠炎病毒载体疫苗种毒可在2-3周内生产出，确保了新疫苗种毒的快速更新，从而应对H5N1野毒的抗原性漂移。

5、重组鸭肠炎病毒载体疫苗

使用同源重组，将H7的HA基因插入到传染性喉气管炎病毒的UL0基因中，构建出重组传染性喉气管炎病毒载体H7禽流感疫苗。这种疫苗可对传染性喉气管炎病毒和H7禽流感产生免疫保护。另外，将H5的HA基因插入到传染性喉气管炎病毒的UL50基因转座子中构建的重组传染性喉气管炎病毒载体疫苗可对同源和异源H5病毒的攻击产生有效保护。当鸡同时免疫一种重组传染性喉气管炎病毒载体N1禽流感疫苗时，重组传染性喉气管炎病毒载体H5禽流感疫苗的效力增强。重组传染性喉气管炎病毒载体疫苗可在鸡胚或原代细胞系上大量繁殖，通过饮水或喷雾引起黏膜免疫。然而，重组传染性喉气管炎病毒载体疫苗仅在传染性喉气管炎病毒流行的少数区域的层养鸡中使用。因此，和其他重组疫苗相比，这种疫苗在控制H5N1禽流感病毒中的作用有限。

三、DNA疫苗

和传统疫苗相比，DNA疫苗有很多优点。

首先，DNA疫苗可产生体液免疫和细胞免疫。

其次，DNA疫苗构建简单，生产、储存成本低。

第三，DNA疫苗可多次免疫来增强免疫效力。

尽管对流感病毒的多种病毒基因进行了研究，在研制DNA疫苗中还是HA基因的保护效果最好。

几个早期的研究表明，表达HA基因的DNA疫苗能有效对抗高致病性H5或H7禽流感病毒。

最近，科学家们致力于研究能更有效对抗H5N1的DNA疫苗。姜永萍等人，构建了一种H5的HA基因optiHA。将optiHA插入到pCAGGS载体中表达构建出一种针对H5亚型禽流感病毒的DNA疫苗。肌内注射后，这种DNA疫苗能产生高HI和中和抗体。免疫100微克或10微克这种DNA疫苗，可完全保护鸡免受H5N1禽流感病毒的攻击。进一步研究表明，当免疫两次10微克这种DNA疫苗，产生的免疫保护效果可持续一年多。这种DNA疫苗经过了临床试验，其在中国的合法性目前在评估中。探讨DNA疫苗的广谱免疫反应也有研究。DNA疫苗可对同源性H5N1病毒提供保护。另外，佐剂，例如MDA5和CD154，可增强DNA疫苗对抗H5N1病毒的免疫效力。

DNA疫苗在鹌鹑中也可发挥保护作用。将来需要进一步研究DNA疫苗在其他禽类如鸭和鹅中的免疫效果。

总结：H5N1禽流感病毒在禽类和野鸟中导致了严重的疾病。实施免疫在减少养禽业损失、降低环境中病毒浓度、确保生物安全、阻止病毒从禽类传播到人等方面发挥了重要作用。经验告诉我们，现代生物技术，例如反向遗传技术，使得流感疫苗的研制更加容易，并可使疫苗具有我们想要的特性，如高繁殖率、低致病性、高免疫原性。

为确保免疫策略在将来依旧有效，必须加快研究不同种类的疫苗，建立最佳动物模型。建立动物模型应该考虑动物的种类、年龄、免疫后的状态以及不同疫苗联合使用的潜在可能性。例如，依据种属设计的重组鸭肠炎病毒载体疫苗在鸭上使用最佳。这解决了在鸭群中极少免疫H5N1疫苗的问题。我们希望这种新的疫苗在不久的将来能极大地减少环境中的病毒量并减少H5N1病毒在禽类中爆发。

四、H5N1禽流感疫苗使用方面的研究进展

1、H5N1 禽流感病毒

禽流感病毒有分节段的单股负链RNA，属于正粘病毒科，分为甲、乙、丙三属。到目前为止，只有甲型流感病毒属可引起禽流感。

根据流感病毒表面的两种糖蛋白血凝素和神经氨酸酶，甲型流感病毒属可分为不同亚型。已经鉴定出甲型流感病毒属有18种血凝素亚型（H1-H18）和11种神经氨酸酶亚型（N1-N11）。其中，H1-H16和N1-N9亚型都是从水禽中分离到的，而H7N10和H18N11病毒从蝙蝠中分离到。

已经检测到H5N1禽流感病毒存在于3个大陆的60余个国家的家禽和野鸟中。需引起注意的是，H5N1禽流感病毒已经在孟加拉、埃及、印度、印度尼西亚、越南的禽类和野鸟中地方性流行。这些发展中国家的禽类养殖体系不完善，几乎没有适当的生物安全措施。这种状况有利于不同来源的病毒重组，增加了病毒多样性，加速了H5N1禽流感病毒在世界范围内的传播。

H5N1禽流感病毒给养禽业乃至整个国家的经济造成了巨大损失。H5N1禽流感病毒在禽类和野鸟中的爆发也给人类健康带来巨大威胁。它们的广泛传播已经导致了641例人类感染的事件，其中380例是致死性的。

最近几个研究揭示H5N1禽流感病毒通过获得α-2,6-唾液酸结合能力或者和2009年H1N1流行毒株重组从而可在哺乳动物中通过气溶胶传播。因此，控制和阻止H5N1禽流感病毒的感染和传播对于保护动物和人类的健康至关重要。

为了应对H5N1禽流感病毒引起的全球威胁，国际组织和国家政府制定了全面的策略来有效控制和阻止H5N1禽流感。

这些策略包括生物安全、扑杀病禽、诊断和监测、通报和宣传以及免疫。在被H5N1禽流感病毒感染的60余个国家中，13个国家已经零星地或是规律地使用免疫策略来防控H5N1禽流感。

2、H5N1禽流感疫苗的使用

考虑到H5N1病毒的全球传播，仅通过扑杀来控制是不可行的。因此，在许多感染国家实施免疫是全面控制措施里的一部分。当H5N1病毒高度流行时，疫苗被作为紧急预防措施。在H5N1病毒肆虐的国家，如中国、埃及、印度尼西亚和越南，已经实施大规模的免疫程序来应对禽流感，这些国家使用的疫苗数量占全球的99%。

3、灭活疫苗的使用

疫苗免疫首次于2002年在香港实施。一种由A/chicken/Mexico/232-CPA/94病毒制备的灭活疫苗在小范围内使用。

2003年起，香港开始实施大规模的免疫程序。

2003年末，H5N1病毒在东南亚的许多国家爆发。

从2004年起，基于反向遗传技术制备的灭活疫苗开始在中国大规模使用以控制H5N1禽流感。

在中国，由A/turkey/England/N28/1973制备的灭活H5N2疫苗在2004-2006年被使用（见表2）。

中国已启动了全国性的监测，一旦出现疫苗毒株的抗原性与流行野毒毒株不符的情况，新的疫苗毒株就跟进研制并快速更新。

到目前为止，基于反向遗传技术制备的这种灭活H5N1疫苗种毒在中国大陆已经被更新三次，包括Re-1, Re-4, Re-5, Re-6。

值得一提的是，两种不同的疫苗种毒产生的三种结合，包括Re-1/Re-4, Re-4/Re-5, Re-4/Re-6, 已经在多种H5N1毒株爆发的地区生产和使用。

在中国使用的这种疫苗也出口到其他国家，包括埃及、印度尼西亚、越南、孟加拉国、缅甸、蒙古，证实了这种疫苗能有效控制H5N1禽流感病毒。

2011年，一种具有A/chicken/Egypt/18-H/09 HA和NA基因的疫苗在埃及被生产和使用。

到目前为止，超过1000亿羽份的灭活疫苗已被使用。

4、重组病毒载体疫苗的使用

除了灭活疫苗，中国也使用了重组病毒载体疫苗。

2005年，少量重组禽痘病毒载体疫苗被使用。

2006年初，一种二价重组新城疫载体H5N1禽流感疫苗rHL5-1在中国被批准使用于鸡。这是全世界范围内第一个由RNA病毒研制生产的活病毒载体疫苗。

目前为止，重组新城疫载体疫苗已经被更新两次，一次是在2008年，使用A/duck/Anhui/1/06的HA基因，一次在2012年，使用A/duck/Guangdong/1322/2006的HA基因。

2006-2012年间，中国生产了超过110亿羽份的二价重组新城疫载体H5N1禽流感疫苗，对鸡进行免疫。

5、总结

H5N1禽流感病毒给家禽和野鸟带来了严重的疾病。实施免疫在减少养禽业损失、降低环境中病毒浓度、确保生物安全、阻止病毒从禽类传播到人等方面发挥了重要作用。

经验告诉我们，现代生物技术，例如反向遗传技术，使得流感疫苗的研制更加容易，并可使疫苗具有我们想要的特性，如高繁殖率、低致病性、高免疫原性。

为确保免疫策略在将来依旧有效，必须加快研究不同种类的疫苗，建立最佳动物模型。建立动物模型应该考虑动物的种类、年龄、免疫后的状态以及不同疫苗联合使用的潜在可能性。

值得注意的是，在国内以及国际上，如果没有一个全面的控制措施，那么有效控制H5N1将成为一个难题。

在中国，国家和省级水平的控制措施已较完备。政府对扑杀的禽类进行经济补偿。在H5N1免疫方面，中央政府负担疫苗的费用，这些费用被分发给养殖户。和免疫一起实施的还有快速诊断和监测、扑杀、宣传以及不断改进的生物安全措施。

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